Ciclofosfamida 98

+

Los fármacos contra el cáncer doxorubicina y ciclofosfamida Ensayo Biología Publicado: 23 de marzo el año 2015 Los medicamentos contra el cáncer disponibles doxorubicina y ciclofosfamida se utilizan en varios tipos de tratamiento del cáncer. En esta práctica, vamos a utilizar las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 para acceder a la sensibilidad de la doxorrubicina y ciclofosfamida in vitro con el método de ensayo de MTT. MCF-7 células de cáncer de mama, líneas de células epiteliales ductales se caracterizan por las funciones del receptor (receptor de estrógeno, receptor de progesterona. Her2 / neu) y estas células son células no adherentes y crecen bien en medios nutrientes con la formación de dome. Chemosensitivity de los efectos del fármaco se miden por el ensayo de MTT. Es un ensayo de proliferación celular que ofrece un método cuantitativo, conveniente para la evaluación de la respuesta de una población de células a factores externos, ya se trate de un aumento en el crecimiento celular, ningún efecto, o una disminución en el crecimiento debido a necrosis o apoptosis. Ambos fármacos son ampliamente utilizados en la práctica clínica, sino que evalúan el efecto de la sensibilidad de ambos fármacos in vitro con el ensayo MTT. Los resultados prácticos y estadísticos muestran que la doxorrubicina tiene el efecto antitumoral significativo en células MCF-7 a pesar de la ciclofosfamida no funcionaba bien in vitro en células de cáncer de mama. Por lo tanto, con la ayuda del ensayo MTT, la eficacia de los medicamentos puede ser determinado para una mejora adicional de desarrollo de fármacos. Profesional ensayistas Obtener su grado o su dinero usando nuestro ensayo escrito servicio! Servicio de redacción de ensayos Las células cancerosas proliferan de forma continua mediante la división celular y la replicación. Los agentes quimioterapéuticos son los fármacos que inhiben la proliferación celular en la fase específica del ciclo celular y destruyen las células malignas, así como las células normales. Con los avances en nuestra comprensión de los efectos de los fármacos quimioterápicos en las células cancerosas tienen más efectos beneficiosos al tratado con la quimioterapia combinada. En nuestra práctica, vamos a evaluar la eficacia de la ciclofosfamida y doxorrubicina en las células MCF-7 de células de cáncer de mama in vitro con el ensayo MTT. MCF-7 (Fundación-7 Cáncer de Michigan) es una línea celular de cáncer de mama aislado en 1970 a partir de una mujer de raza blanca de 69 años de edad, y se han estudiado ampliamente como un modelo para el crecimiento de células de cáncer de mama. Las células MCF-7 se caracterizan por receptor autocrina, tales como el estrógeno, la progesterona y factor de crecimiento epidérmico de Her2 / neu. MCF-7 células son aisladas de líneas celulares de mamífero de las células de cáncer de mama y se mantienen al crecimiento en cultivo celular. Hay varios tipos de cultivos de células: cultivo de células primarias en el que las células son directamente de un sujeto, cultivo celular secundaria, cultivo de células continua, cultivo de células inmortalizadas y cultivo de células de hibridoma. En nuestra práctica, las células MCF-7 se suministran de ATCC (centro de recursos biológicos) y luego se subcultivaron por explantes de excrecencia de la capacidad de proliferation. Then, almacenar las células mediante el método de criopreservación de congelación de las células en isopropanol, que impiden que la tapa y el dedo pegado congelado a 1'c / min hasta alcanzar la -80'C y transfiere las células en el recipiente de nitrógeno líquido a -196'C sin pérdida sustancial de viabilidad celular. De esta manera, las células MCF-7 de cáncer de mama se mantienen durante más investigaciones de laboratorio. La ciclofosfamida es un agente alquilante de ADN y nitrógeno depende de mostaza ciclo celular que tiene un amplio espectro de actividad contra una variedad de neoplasias. Un agente de alquilación añade un grupo alquilo a ADN y se une el grupo alquilo a la base guanina de hebras de ADN entre y dentro, en el átomo de nitrógeno número 7 del anillo de imidazol y conduce a la muerte celular. Es un profármaco y los efectos citotóxicos de la ciclofosfamida depende de su metabolismo por microsomes. Cyclophosphamide hepática se convierte al metabolito 4-hidroxiciclofosfamida (isómero de aldofosfamida) por las enzimas oxidasa en el hígado. Phosphoramide mostaza es más probable alquilantes metabolitos que alquilatos bajo condiciones fisiológicas que es directamente citotóxico para las células. La ciclofosfamida también se convierte en acroleína que es tóxico para el epitelio de la vejiga y puede conducir a la cistitis hemorrágica. Estructura de la ciclofosfamida (Figura se toma de en. wikipedia. org/wiki/File:Mttscheme. png) La doxorrubicina es el miembro de la familia antraciclina y que es una versión hidroxilado de daunorrubicina. Se intercala entre los pares de bases en el ADN de doble hélice, lo que impide la replicación del ADN y en última instancia, la inhibición de la síntesis de proteínas. Además, también inhibe la actividad de una enzima, la topoisomerasa II que se traduce en un complejo ligado escindible enzima-DNA aumentado y estabilizado durante la replicación del ADN y, posteriormente, impide la ligadura de la cadena de nucleótidos después de la escisión de doble cadena, deteniendo de este modo la replicación del ADN. La doxorrubicina es ampliamente utilizado en varios tipos de cáncer en hematopoyético, linfoma, de mama y cáncer de pulmón, pero tiene la cardiotóxicos indeseable efecto que el daño al corazón en un individuo. Exhaustivo Servicios de Redacción - Plagio libre siempre a tiempo los marcados Estándar estructura de la doxorrubicina (Figura se toma de en. wikipedia. org/wiki/File:Mttscheme. png) Para la detección de sensibilidad a los fármacos a las células tumorales, hay muchos chemosensitivity ensayos utilizados en la investigación clínica. Son 3- (4-5-dimetiltiazol-2-il) -2-5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) de ensayo, 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5 - [(phenlamio) carbonil)] hidróxido de 2H-tetrazolio (XTT) de ensayo, sulfordamina B (SRB) ensayo de proteínas de manchas, ensayo de formación de colonias, ensayo de receptores de estrógenos, ensayo de agar blando estándar y ensayo de fibra hueca (HF). Estas pruebas también son necesarios para la identificación de nuevo contra el cáncer ensayo drugs. MTT se ha utilizado en los agentes quimioterapéuticos programa del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) desde 1991 y se informó de detección para mostrar la exactitud en más de 90% de los pacientes (Kim et al.2003) En nuestra práctica, vamos a aplicar el ensayo MTT para cumplir con nuestro objetivo de evaluación de dos fármacos. Es una prueba de laboratorio y ensayo colorimétrico estándar se introdujo para su uso en inmunología en 1983.It es también sensible para su uso en ensayos de inhibición de crecimiento. La sal tetrazolum amarillo (MTT) se reduce en las células metabólicamente activas para formar cristales de formazán de color púrpura insoluble, que se solubilizan mediante la adición de detergente. Se da una relación lineal entre el número de células y la absorbancia se establece, lo que permite la cuantificación precisa y directa de cambios en la proliferación. Utilidad del método MTT proporcionar las medidas precisas mediante la detección de los cambios en el metabolismo celular con procedimiento espectrofotométrico. Por otra parte, es así que las sustancias no radiactivas reactivos más seguros que otros. Es fácil de usar y rápido procesamiento y almacenamiento conveniente para un periodo prolongado. (Figura se toma de en. wikipedia. org/wiki/File:Mttscheme. png) Material y métodos Materiales y Equipos para el cultivo de células líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 se soportan de ATCC o NCI. ICONA medio de cultivo celular, apropiado para la línea celular frascos de cultivo de tejido de tamaños apropiados placas de cultivo de tejidos-96 así pipetas estériles, tamaños variados pipeta multicanal y puntas esterilizadas pipetas Pasteur estéril desenchufado placas de Petri estériles Campana de flujo laminar bomba de vacío y el frasco I. Protocolo para el cultivo celular Preparar el capó, limpie todas las superficies con un 70% de etanol durante condiciones asépticas y trajo los reactivos y materiales a la campana para iniciar el procedimiento. Los crioviales que se ha mantenido en nitrógeno líquido o en el congelador y el vial -196'C descongelar inmediatamente en un baño de agua de 37 'C. contenido de deshielo con batido ligero hasta que sólo pequeña de hielo se deja en el vial. Por lo general toma 1 min. Spray vial con 70% de etanol en todo y frote la superficie con papel de limpieza en la campana Abrir el vial y transferir el contenido a un tubo Falcon de 15 ml que ya contiene 5 ml de medio fresco. Centrifugar a 1000 rpm o 200 g durante 35 min a 4'C. Aspirate sobrenadante. Resuspender las células en medio fresco y la transferencia de placa de cultivo. Las células se cultivan en una incubadora y necesidad medio que ser cambiado por cada 3 días. Compruebe la célula bajo el microscopio Para pases de las células, cuando subcultivo es confluencia apropiada, subcultivo puede llevarse a cabo. Retire el medio del plato. Brevemente enjuague la capa de células con 0,25% (w / v) de solución de tripsina-EDTA 0,53 mM para eliminar todos los rastros de suero que contiene inhibidor de la tripsina. Añadir 2 a 3 ml de solución Trypsi-EDTA para observar las células del matraz y bajo un microscopio invertido hasta desprenderse. Las células que son difíciles de separar pueden ser colocados en 37 'C para facilitar la dispersión. Añadir 6 a 8 ml de medio de crecimiento y células de aspirado completos pipeteando suavemente. Transferir la suspensión celular a el tubo de centrífuga con el medio y las células, y se centrifuga a aproximadamente 12000rpm para 2 min. Descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en medio de crecimiento. Add alícuotas apropiadas frescas de la suspensión celular a nuevo. Mantener la célula en 37 'C 5% incubadora de CO2. II. Setting por el carril Experimento Bajo condiciones asépticas de Flujo Laminar Hood, contamos con 96 pozos que contienen 2 placas de cultivo y 2 fármacos diferentes (doxorubicina y ciclofosfamida) con diferentes concentraciones. En primer lugar, etiquetamos cada placa de acuerdo con el fármaco vamos a access.200ul de RPMI se añadió en 1640 el carril 1 de la fila A a H como control negativo. 180 ul de células MCF-7 ya la suspensión se llenaron por un técnico de laboratorio. Este ensayo es Trabajo de un estudiante Este ensayo ha sido presentado por un estudiante. Este no es un ejemplo de la obra escrita por nuestros ensayistas profesionales. Ejemplos de proyectos Después, se añadieron 20 ul de medio RPMI 1640 que en el carril 2 de la fila A a H como un control positivo. Para una prueba, ponemos 20 ul de doxorrubicina con la disminución de la concentración de duplicación (1, 0,5, 0,25, 0,0625, 0,03, 0,016, 0,008, 0,004, y 0,002) desde el carril 3 con el carril 12 en la fila de la A a la H, respectivamente. A continuación, la placa se incubó a 37 'C durante 4 días para la reacción apropiado. Este procedimiento se repitió el mismo para ciclofosfamida. III. Accessing respuesta celular al fármaco citotóxico Después de 4 días, se añadió 20 ul de MTT (5 mg / ml). Las placas se cultivaron a 37 'C durante 4 horas en la que 37' C es la temperatura para la escisión de MTT y el tiempo óptimo puede variar de acuerdo con el ensayo, pero 4 horas es adecuado para la mayoría de los propósitos. (Este paso se llevó a cabo por el laboratorio técnico). Entonces, 200 ul de medio de más MTT de cada pocillo se retiró cuidadosamente y se desechó sin tocar el fondo del pozo para evitar la perturbación de la cells.150ul de DMSO se añadió a cada pocillo para disolver los cristales formazon homogéneamente. La cantidad de DMSO depende de los cristales formazon y más DMSO dar mayor color. La solución se mezcló a fondo y de la lectura de la absorbancia se leyó a 490 nm en el espectrofotómetro. La siguiente fórmula se utiliza para obtener la concentración final del fármaco. En nuestra mesa, el porcentaje de supervivencia de las células de diferentes concentraciones de ambos fármacos se calcula utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de supervivencia de las células del carril específico = Absorbancia del tratado en el carril específico f drogas absorbancia media del control positivo Tabla 1: lectura de la absorbancia a 490 nm, el porcentaje de supervivencia, y la desviación estándar de los valores de ciclofosfamida Lane (conc Drogas.) (M)